体检查出结核T-spot"阳"了！莫要慌张，听专家和你讲清楚

（一）病因和发病机制

1．结核菌引起人类结核病的主要为人型结核杆菌，牛型少见。

2．感染途径呼吸道感染是肺结核的主要感染途径，飞沫感染为最常见的方式。只有受大量毒力强的结核菌侵袭，而人体免疫力低下时，感染后才发病。传染源主要是排菌的肺结核患者的痰液。感染的次要途径是经消化道进入体内。

3．人体的反应性

（1）免疫与变态反应人体对结核菌的自然免疫力是非特异性的。接种卡介苗或经过结核菌感染后所获得的免疫力则具有特异性。能把入侵结核菌杀死或严密包围，制止扩散，促进病灶愈合。获得性免疫强于自然免疫。一些疾病如糖尿病或使用免疫抑制剂可使人体免疫力减低，容易发生结核病，或使原已稳定的疡灶重新活动。

结核病的免疫主要是细胞免疫，表现为淋巴细胞的致敏与吞噬细胞功能的增强。当致敏细胞再次遇到结核菌，释放一系列淋巴因子，使巨细胞聚集，吞噬杀灭细菌，后变成类上皮细胞，郎罕巨细胞，形成结核结节，局限病灶。

结核菌侵入人体后4～8周，身体组织对结核菌及其代谢产物所发生的敏感反应称为变态反应，与T淋巴细胞释放的炎症介质、皮肤反应因子及淋巴细胞毒素等有关。此时，结核菌素皮肤试验阳性。(何为结核菌素试验?)属于第Ⅳ型(迟发型)变态反应。

（2）初感染与再感染机体对结核菌再感染与初感染所表现出不同反应的现象，称为科赫(Koch)现象。

（二）结核菌感染与肺结核的发生、发展

肺结核分原发性与继发性两大类。原发性肺结核，是指结核菌初次感染而在肺内发生的病变，常见于小儿。病灶局部反应轻微结核菌常沿淋巴管到达淋巴结。继发性肺结核通常发生在曾受过结核菌感染的成年人。肺内局部病灶处炎症反应剧烈，容易发生干酪样坏死及空洞。

1．原发型肺结核当人体抵抗力降低时，吸入的结核菌在肺部形成渗出性病灶，部位多在上叶底部、中叶或下叶上部(肺通气较大部位)，引起淋巴结炎及淋巴管炎，原发病灶及淋巴结均可发生干酪样坏死。肺部的原发病灶、淋巴管炎及局部淋巴结炎，统称原发综合征。

2．血行播散型肺结核多由原发型肺结核发展而来，但在成人大多由肺或肺外结核病灶如泌尿生殖道的干酪样病变，破溃至血管引起，急性粟粒型肺结核是急性全身血行播散结核病的一部分。

3．浸润型肺结核原发感染经血行播散(隐性菌血症)而潜伏在肺内的结核菌多数逐渐死亡，仅当人体免疫力降低时，潜伏在病灶内的结核菌始有机会繁殖，形成以渗出与细胞浸润为主、伴有程度不同的干酪样病灶，称为浸润型肺结核(内源性感染)。原发病灶亦可能直接进展成浸润型肺结核。继发型肺结核以浸润型最常见，多为成年人。浸润性肺结核伴大量干酪样坏死灶时，呈急性进展具有高度毒血症状，称干酪性肺炎。干酪性肺炎坏死灶部分消散后，形成纤维包膜，空洞引流支气管不畅，干酪物不能排出，凝成球状病灶，称“结核球”。

4．慢性纤维空洞型肺结核肺结核未及时发现或治疗，空洞长期不愈，空洞壁增厚，病灶出现广泛纤维化；随机体免疫力的高低波动，病灶吸收、修复与恶化、进展交替发生，成为慢性纤维空洞型肺结核。病灶多有反复支气管播散病程迁延，症状起伏，X线可见厚壁空洞。

（三）临床表现

典型肺结核起病缓慢，病程较长，有低热、倦怠、食欲不振、咳嗽及少量咯血，多数患者病灶轻微，多无明显症状。

1．症状

（1）全身症状表现为午后低热、乏力、食欲减退、消瘦、盗汗等。若肺部病灶进展播散，常呈不规则高热。妇女可有月经失调或闭经。

（2）呼吸系统症状通常为干咳或带少量粘液痰，继发感染时，痰呈粘液脓性。约1／3患者不同程度咯血，中等程度咯血，多为小血管损伤或空洞血管瘤破裂。咯血后常有低热。大咯血时可发生失血性休克；偶因血块阻塞大气道引起窒息。此时患者极度烦躁、心情紧张、挣扎坐起、胸闷气促、发绀，应立即进行抢救。慢性重症肺结核时，呼吸功能减退，常出现渐进性呼吸困难，甚至缺氧发绀。若并发气胸或大量胸腔积液，其呼吸困难症状尤为严重。当炎症波及壁层胸膜，可有不剧烈的胸壁刺痛。

2．体征患侧肺部呼吸运动减弱，叩诊呈浊音，听诊时呼吸音减低，或为支气管肺泡呼吸音。肺结核好发上叶尖后段下叶背段，锁骨上下、肩胛间区叩诊略浊，咳嗽后偶可闻及湿啰音，对诊断有参考意义。

肺部病变发生广泛纤维化或胸膜粘连增厚时，患侧胸廓常呈下陷，肋间隙变窄、气管移位与叩浊，对侧可有代偿性肺气肿征。

（四）实验检查

1．结核菌检查确诊肺结核最特异的方法，痰中找到结核菌是确诊的主要依据。涂片抗酸染色镜检，直接厚涂片，荧光显微镜检查，清晨的胃洗液找结核菌，成人可用纤支镜检查。痰菌量少，可用培养法，聚合酶链反应PCR法特异性较强，但有假阳性和假阴性。

2．影像学检查胸部X线检查可以发现肺内病变的部位、范围、有无空洞或空洞大小、洞壁厚薄等(肺结核常见的X线征象有哪些?)。胸部CT检查对于发现微小或隐蔽性病变，了解病变范围及肺病变鉴别等方面均有帮助。

3．结核菌素试验诊断结核感染的参考指标，PPD不产生非特异反应。

4．其他检查血像、血沉、酶联免疫吸附试验(ELISA法)、纤支镜检查、取活组织作病理检查、浅表淋巴结活检。

（五）诊断

1．肺结核分为五型I型：原发性肺结核；Ⅱ型：血行播散型肺结核；Ⅲ型：浸润型肺结核；Ⅳ型：慢性纤维空洞型肺结核；V型：结核性胸膜炎。

2．病变范围及空洞部位按右、左侧，分上、中、下肺野记述

3．痰结核菌检查

4．活动性及转归

（1）进展期应具备下述一项：新发现的活动性病变；病变较前恶化、增多；新出现空洞或空洞增大；痰菌阳性。具备上述一项者，即属进展期。

（2）好转期具有以下一项为好转：病变较前吸收；空洞闭合或缩小；痰菌转阴。

（3）稳定期病变无活动性，空洞闭合，痰菌连续阴性(每月至少查痰1次)达6个月以上。如空洞仍存在，则痰菌需连续阴性1年以上。

开放性肺结核是指肺结核进展期与部分好转期患者，其痰中经常有结核菌排出，具有较强的传染性，故必须隔离治疗。

活动性肺结核是指渗出性浸润病变或变质性病变如干酪样坏死、空洞形成、支气管播散及血行播散粟粒型结核，临床上症状比较突出。进展期与好转期均属活动性肺结核。

稳定期患者属非活动性肺结核，列为初步治愈。

（六）鉴别诊断

1．肺癌肺癌多见于40岁以上嗜烟男性；常无明显毒性症状，多有刺激性咳嗽为刺激性干咳，痰中带血、胸痛及进行性消瘦。X线胸片肺门阴影癌肿病灶边缘常有切迹、毛刺。结合痰结核菌、脱落细胞检查及通过纤支镜检查及活检等，常能及时鉴别。必要时可考虑剖胸探查。

2．肺炎起病急骤、高热、寒战、胸痛伴气急，咳铁锈色痰，X片征象病变常局限一叶，抗生素治疗有效。干酪样肺炎则多有结核中毒症状，起病较慢，咳黄色粘液痰，X线征象病变多位于右上叶，可波及右上叶尖、后段，呈云絮状、密度不均，可出现虫蚀样空洞，抗结核治疗有效，痰中易找到结核菌。但轻度咳嗽，低热的支原体肺炎，病毒性肺炎，过敏性肺炎在X线有肺部炎症征象，应注意与早期浸润型肺结核鉴别。

3．肺脓肿结核好发上叶、锁骨上下或下叶背段，而肺脓肿空洞多见于肺下叶，脓肿周围的炎症浸润较严重，空洞内常有液平面。肺结核空洞则多发生于肺上叶，空洞壁较薄，洞内很少有液平面。肺脓肿起病较急，高热，大量脓痰，痰中无结核菌，但有多种其他细菌。血白细胞总数及嗜中性粒细胞增多，抗生素治疗有效。痰结核菌阴性。下叶肺结核应与下叶肺脓肿注意鉴别。

4．支气管扩张有慢性咳嗽，咳痰，反复咳血史，痰结核菌阴性，X线胸片多无异常发现或仅见局部肺纹理增粗或卷发状阴影，CT有助确诊。

5．慢性支气管炎及时X线检查有助确诊。

6．其他发热性疾病伤寒、败血症、白血病、纵隔淋巴瘤及结节病等与结核病有诸多相似。①伤寒热型常呈稽留热，有相对缓脉、皮肤玫瑰疹，血清伤寒凝集试验阳性，血、粪便伤寒杆菌培养阳性。易与急性粟粒性肺结核混淆。②败血症起病急、寒战及弛张热型，白细胞及中性粒细胞增多，常有近期皮肤感染，疮疖挤压史或尿路、胆道等感染史，皮肤瘀点，病程中出现迁徙病灶或感染性休克，血或培养可发现致病菌。③淋巴瘤发展迅速，常有肝脾及浅表淋巴结肿大，确诊常需依赖活检。结节病通常不发热，肺门淋巴结肿大多为双侧性，结素试验阴性，血管紧张素转化酶活性测定阳性，抗原皮肤试验阳性。糖皮质激素治疗有效，必要时应作活检以明确诊断。

（七）预防

控制传染源、切断传染途径及增强免疫力、降低易感性等，是控制结核病流行的基本原则。

1．防治系统建立与健全各级防痨组织是防治工作的关键。

2．查出病人结核病的传染源是排菌患者。患者有症状而就诊于综合医院，经X线检查确诊，是我国目前发现患者的主要渠道。无症状患者，须主动寻找，发现并治愈涂阳病人为切断传染链最有效方法。

3．管理患者对肺结核患者进行登记，加强管理。WHO于1995年提出“控制传染源”和“监督治疗+短程化学治疗”的战略。

4．治疗场所有效抗结核药物在家中或在医院治疗效果同样满意，在家中治疗可节省人力物力。

5．卡介苗接种(BCG)接种对象是未受感染的新生儿、儿童及青少年。已受结核菌染者(结素试验阳性)已无必要接种，否则引起Koch反应。

（八）治疗

1．抗结核化学药物治疗

（1）合理化疗是指对活动性结核病坚持早期、联用、适量、规律和全程使用敏感药物的原则。异烟肼与利福平称全杀菌剂。链霉素及吡嗪酰胺作为半杀菌剂。乙胺丁醇、对氨基水杨酸钠等均为抑菌剂。(各种常用抗结核药物作用机制要清楚)。

（2）化疗方法

①“标准”化疗与短程化疗过去采用12～18个月疗法，称“标准”化疗，现在采用6～9个月疗法(短程化疗)。短程化疗方案中要求必须包括两种杀菌药物，异烟肼及利福平。

②间歇用药、两阶段用药，在开始化疗的1～3个月内，每天用药(强化阶段)，以后每周3次间歇用药(巩固阶段)，效果并无明显差异。

③督导用药医护人员按时督促用药，加强访问，取得患者合作尤为必要。

（3）抗结核药物

①异烟肼(isoniazid,H)杀菌力强抑制结核菌DNA合成，阻碍细胞壁合成。口服后，吸收快，渗入组织，通过血脑屏障，杀灭细胞内外的代谢活跃或静止的结核菌。胸水、干酪样病灶及脑脊液中的药物浓度亦相当高。

②利福平(rifampin,R)对细胞内、外代谢旺盛及偶尔繁殖的结核菌均有作用，抑制结核菌体RNA聚合酶，阻碍mRNA合成。常与异烟肼联合应用。

③链霉素(streptomycin,S)链霉素能干扰菌酶活性，阻碍蛋白质合成。主要不良反应为第8对颅神经损害，严重者应及时停药，肾功能严重减损者不宜使用。

④吡嗪酰胺(Pyrazinamide,Z)能杀灭吞噬细胞内、酸性环境中的结核菌。

⑤乙胺丁醇(ethambutol,E)对结核菌有抑菌作用，结合其他抗结核药物时，可延缓细菌对其他药物产生耐药性。剂量过大可引起球后视神经炎，中心盲点红绿色盲等。

⑥对氨基水杨酸钠(sodium Paraaminosalicylate,P)抑菌药，与链霉素、异烟肼或其他抗结核药联用，可延缓对其他药物发生耐药性与对氨苯甲酸竞争，影响结核菌代谢。

（4）化疗方案

1）初治方案初治涂阳病例均可用以异烟肼(H)利福平(R)及吡嗪酰胺(z)组合为基础的6个月短程化疗方案。

I前2个月强化期用链霉素(或乙胺丁醇)、异烟肼、利福平及吡嗪酰胺，每日1次；后4个月继续用异烟肼及利福平，每日1次，以2S(E)HRZ／4HR。

Ⅱ亦可在巩固期隔日用药(即每周用药3次)，以2S(E)HRZ／4H3R3。

Ⅲ亦可全程间歇用药，以2S３(E3)H3R3Z3／4H3R3表示。

Ⅳ强化期用异烟肼、链霉素及对氨基水杨酸钠(或乙胺丁醇)，巩固期用2种药10个月，以2HSP(E)／10Hp(E)表示。

V强化期1个月用异烟肼、链霉素，巩固期11个月每周用药2次，以IHS／11H2S2表示。I、Ⅱ、Ⅲ为短程化疗方案，Ⅳ、V为“标准方案”。若条件许可，尽量使用短程化疗方案。初治涂阴培阴患者，除粟粒性肺结核或有明显空洞患者可采用初治涂阳的方案外，可用以下化疗方案：①2SHRZ／2H2R2；②3H2R2Z2／2H2R2(全程隔日应用)；③1SH／11H2S2(或E)。

2）复治方案复治病例应选择联用敏感药物。

Ⅰ2S(E)HRZ／4HR，督促化疗，保证规律用药。6个月疗程结束时，若痰菌仍未转阴，巩固期可延长2个月。如延长治疗仍痰菌持续阳性，可采用下列复治方案。

Ⅱ初治规则治疗失败的患者，可用2S3H3Z3E3／6H3R3E3。

Ⅲ慢性排菌者可用敏感的一线药与二线药联用，如卡那霉素卷曲霉素等，疗程以6～12个月为宜。

2．对症治疗

（1）毒性症状结核病的毒性症状在有效抗结核治疗1～2周内多可消失，通常不必特殊处理。干酪样肺炎、急性粟粒性肺结核、结核性脑膜炎有高热等严重结核毒性症状，或结核性胸膜炎伴大量胸腔积液液者，均应卧床休息及尽早使用抗结核药物。皮质激素应在有效的抗结核治疗基础上慎用。如症状很重，在加用有效抗结核药物同时，加用皮质激素，如泼尼松。可以减轻过敏反应。

（2）咯血中等或大量咯血时应严格卧床休息，胸部放置冰袋，并配血备用。可用垂体后叶素缓慢静脉注入。

若咯血量过多，可酌情适量输血。咯血窒息是咯血致死的主要原因，抢救措施中应特别注意保持呼吸道通畅，

采取头低脚高45°的俯卧位，轻拍背部，迅速排出积血，并尽快挖出或吸出口、咽、喉、鼻部血块。必要用硬质气管镜吸引、气管插管或气管切开，以解除呼吸道阻塞。大量咯血不止，可纤支镜确定出血部位后，用肾上腺素海绵压迫或填塞出血部位止血。

3．手术治疗可做肺叶或全肺切除。手术治疗禁忌证有：支气管粘膜活动性结核病变，而又不在切除范围之内者；全身情况差或有明显心、肺、肝、肾功能不全者。

美国体检详解

本指导原则旨在指导注册申请人对白蛋白测定试剂（盒）注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。

本指导原则是对白蛋白测定试剂（盒）的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。

本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导文件，不涉及注册审批等行政事项，亦不作为法规强制执行，如有能够满足法规要求的其他方法，也可以采用，但应提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。

本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准体系的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。

一、适用范围

依据《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号）和《食品药品监管总局关于印发体外诊断试剂分类子目录的通知》（食药监械管〔2013〕242号），本指导原则适用于按Ⅱ类医疗器械管理的白蛋白检测试剂（盒），产品类别为：Ⅱ-1用于蛋白质检测的试剂。

白蛋白测定试剂（盒）适用于使用溴甲酚绿法（BCG）、溴甲酚紫法（BCP）对血清、血浆中白蛋白进行定量检测的白蛋白测定试剂（盒），包括手工试剂和在半自动、全自动生化分析仪上使用的试剂。

本指导原则不适用于干化学方法测定白蛋白试剂（盒）。

二、注册申报资料要求

（一）综述资料

白蛋白是属于球蛋白的一种蛋白质。广泛分布在各种动植物中，在人体血液，组织液中含有白蛋白，它最重要的作用是维持胶体渗透压。白蛋白的分子结构含585个氨基酸残基的单链多肽，分子量为66458，分子中含17个二硫键，不含有糖的组分。在体液pH7.4的环境中，白蛋白为负离子，每分子可以带有200个以上负电荷。它是血浆中很重要的载体，许多水溶性差的物质可以通过与白蛋白的结合而被运输。白蛋白（又称清蛋白，albumin,Alb）是由肝实质细胞合成，在血浆中的半寿期约为15—19天，是血浆中含量最多的蛋白质，占血浆总蛋白的40%—60%。其合成率虽然受食物中蛋白质含量的影响，但主要受血浆中白蛋白水平调节，在肝细胞中没有储存，在所有细胞外液中都含有微量的白蛋白。白蛋白是血浆中含量最多、分子最小、溶解度大、功能较多的一种蛋白质。白蛋白增高主要见于血液浓缩而致相对性增高，如严重脱水和休克、严重烧伤、急性出血、慢性肾上腺皮质功能减低症。白蛋白降低常见于肝硬化合并腹水及其他肝功能严重损害(如急性肝坏死、中毒性肝炎等)营养不良、慢性消耗性疾病、糖尿病、严重出血肾病综合征等。

综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、研究结果的总结评价以及同类产品上市情况介绍等内容，其中同类产品上市情况介绍部分应着重从方法学、临床应用情况、性能指标等方面写明拟申报产品与目前市场上已获批准的同类产品之间的异同。应符合《体外诊断试剂注册管理办法》和《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》（国家食品药品监督管理总局公告2014年第44号）的相关要求。

（二）主要原材料研究资料（如需提供）

1.试剂盒所用与白蛋白结合的染料（如溴甲酚绿或溴甲酚紫）详细试验资料。如外观、纯度或试剂等级，供应商信息和资质，采购合同、原辅料性能指标及合格证（检验证书）等。

2.企业内部参考品（白蛋白标准液）的原料选择、制备、定值过程及试验资料；白蛋白标准液的溯源性文件，包括具体溯源链、实验方法、数据及统计分析等详细资料。白蛋白已具备有证参考物质（如CRM470、ERM/IFCC），生产企业内部白蛋白标准品（液）应通过建立自己的参考品体系并溯源。

（三）主要生产工艺及反应体系的研究资料（如需提供）

1.主要生产工艺介绍，可以流程图方式表示，并简要说明主要生产工艺的确定依据。

2.产品反应原理介绍。

3.检测体系反应条件确定：申请人应考虑反应时间、反应温度、实验参数、仪器型号等条件对产品性能的影响，通过试验确定上述条件的最佳组合。

4.检测体系中样品加样方式及加样量确定：申请人应考虑样品加样方式、加样量对产品检测结果的影响，通过实验确定最佳的加样方式及加样量。如样本需采取稀释或其他必要的方法进行处理后方可用于最终检测，申请人还应对可用于样本稀释的物质或处理方法进行研究，通过试验确定最终选择的用于样本稀释的物质或处理方法。

5.不同适用机型的反应条件如果有差异应分别详述。

（四）分析性能评估资料

企业应提交制造商在产品研制阶段对试剂盒进行的所有性能验证的研究资料，包括具体研究方法、实验数据、质控标准、统计分析等详细资料。对于白蛋白测定试剂（盒）建议选择多批产品对以下分析性能进行研究：分析灵敏度、线性范围、精密度、准确度等指标。

对于适用多个机型的产品，应提供如产品说明书【适用仪器】项中所列的所有型号仪器的性能评估资料及其实验参数。

性能评估应采用临床样本，并尽量采用异常人群（低蛋白血症、肝硬化患者）样本，如果线性范围低端样本不足，可以考虑补充低风险患者样本或健康人群。

1.分析灵敏度：分析灵敏度的确定常使用同批号试剂对已知浓度样品（或有证参考物质）在试剂盒规定参数读数点下的吸光度值（A）或差值（ΔA），换算成40.0g/L的吸光度或吸光度差值。

2.线性范围：建立试剂线性范围所用的样本基质应尽可能与临床实际检测的样本相似，理想的样本为分析物浓度接近预期测定上限的混合人血清，且应充分考虑多倍稀释对样本基质的影响。

3.精密度：测量精密度的评估应至少包括两个浓度水平的样本进行，两个浓度都应在试剂盒的测量范围内且有一定的临床意义（医学决定水平），通常选用该检测指标的正常参考区间附近和异常高值样本。两个浓度都选用高值样品，可能致CV偏小，也不能选用接近最低检出限的样品，可能致CV偏大。

4.准确度

（1）与企业内部白蛋白校准品（液）的比对研究

使用已溯源的企业内部定值参考品进行验证，重点观察检测结果的偏差情况。

（2）方法学比对

采用参考方法或国内/国际普遍认为质量较好的已上市同类试剂作为参比方法，与拟申报试剂同时检测临床样品，从测定结果间的差异了解拟申报试剂与参比方法间的偏倚。

在实施方法学比对前，应分别对拟申报试剂和对比试剂进行初步评估，只有在确认两者都分别符合各自相关的质量标准后方可进行比对试验。方法学比对时应注意质量控制、样本类型、浓度分布范围并对结果进行合理的统计学分析。

5.干扰物质及交叉反应研究。

（五）参考区间确定资料

参考区间确定所采用的样本来源、确定方法及详细的试验资料。

（六）稳定性研究资料

稳定性研究资料主要涉及申报试剂的稳定性研究。包括效期稳定性（实时稳定性）、运输稳定性、开瓶稳定性及热稳定性等研究，申请人可根据实际需要选择合理的稳定性研究方案。稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、具体的实施方案、详细的研究数据以及结论。对于效期稳定性研究，应提供至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。

（七）临床评价资料

试剂（盒）按照《体外诊断试剂注册管理办法》及《关于发布体外诊断试剂临床试验技术指导原则的通告》（国家食品药品监督管理总局通告2014年第16号）进行临床试验。

1.研究方法

选择境内已批准上市、临床普遍认为质量较好的同类产品作为对比试剂，采用试验用体外诊断试剂（以下称考核试剂）与之进行对比试验研究，证明本品与已上市产品等效或优于已上市产品。建议企业尽量选择方法学相同、线性范围及精密度等性能接近的同类试剂作为对比试剂。

2.临床试验机构的选择

（1）第二类产品申请人应当选定不少于2家（含2家）国家食品药品监督管理总局资质认可的临床试验机构开展临床试验。

（2）临床试验机构应有能力提供临床评价所需的各类样本，实验操作人员有足够的时间熟悉检测系统的各环节（仪器、试剂、质控及操作程序等），熟悉临床试验方案。在整个实验中，考核试剂和对比试剂都应处于有效的质量控制下，定期对仪器进行校准，最大限度保证试验数据的准确性及可重复性。

（3）不同的临床试验机构应尽可能使用同一批次考核试剂进行临床试验，以便对数据进行科学客观的统计分析。

（4）对比试剂统一。

3.临床试验方案

临床试验实施前，研究人员应从流行病学、统计学、临床医学、检验医学等多方面考虑，设计科学合理的临床研究方案。各临床研究机构的方案设置应基本一致，且保证在整个临床试验过程中遵循预定的方案实施，不可随意改动。整个试验过程应在临床研究机构的实验室内并由本实验室的技术人员操作完成，申报单位的技术人员除进行必要的技术指导外，不得随意干涉实验进程，尤其是数据收集过程。

试验方案中应确定严格的病例纳入/排除标准，任何已经入选的病例再被排除出临床研究都应记录在案并明确说明原因。在试验操作过程中和判定试验结果时应采用盲法及样本随机分配以保证试验结果的客观性。对于新方法测定白蛋白试剂建议明确测定原理或方法学定义的研究，应在方案中明确前后两次浓度变化有临床意义的标准。临床试验中所涉及的样本类型应与产品说明书一致，且每种样本类型例数的选择应符合基本的统计学要求。临床试验机构选用的对比试剂与其适用机型匹配。

4.研究对象选择

4.1临床试验样本量的确定：申请人或临床研究者应根据产品临床使用目的，与该产品相关疾病的临床发生率确定临床研究的样本量。在符合指导原则有关最低样本要求的前提下，还应符合统计学要求。

4.1.1临床研究的总样本数至少为200例。

4.1.2应考虑样本量的分布。样本量的选择应符合统计学及相关指导原则的要求。

4.1.3样本浓度应覆盖考核试剂检测范围，尽可能均匀分布。不少于30%样本的测定值处于参考区间以外，但在测量范围内。

4.2如果考核试剂同时适用于血清或血浆样本类型，可完成一个样本类型（血清或血浆）不少于200例的临床研究，同时可选至少100例血清或血浆同源样本进行比对研究。

4.3建议在临床试验中选择部分含干扰物质的标本进行对比研究，包括高脂、溶血、黄疸的样本。血清中多种蛋白成分如a1-球蛋白、转铁蛋白、触珠蛋白也会和BCG或BCP反应，以从临床角度验证对试剂的影响。

5.统计学分析

对临床试验结果的统计应选择合适的统计方法，如相关分析、线性回归、受试者工作特征（Receiver Operating Characteristic curve，ROC）曲线分析等。对于对比实验的等效性研究，最常用是对考核试剂和对比试剂两组检测结果的相关及线性回归分析，应重点观察相关系数（r值）或判定系数（R2）、回归拟合方程（斜率和y轴截距）等指标。结合临床试验数据的正/偏态分布情况，建议统计学负责人选择合理的统计学方法进行分析，统计分析应可以证明两种方法的检测结果无明显统计学差异。在临床研究方案中应明确统计检验假设，即评价考核试剂与对比试剂是否等效的标准。

6.结果差异样本的验证

在数据收集过程中，对于两种试剂的检测结果有明显差异的样本，应采用临床上普遍认为质量较好的第三种同类试剂进行验证试验，同时结合患者的临床病情对差异原因及可能结果进行分析。

7.临床试验总结报告撰写

根据《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》的要求，临床试验报告应该对试验的整体设计及各个关键点给予清晰、完整的阐述，应该对整个临床试验实施过程、结果分析、结论等进行条理分明的描述，并应包括必要的基础数据和统计分析方法。建议在临床总结报告中对以下内容进行详述。

7.1临床试验总体设计及方案描述

7.1.1临床试验的整体管理情况、临床试验机构选择、临床主要研究人员简介等基本情况介绍；

7.1.2病例纳入/排除标准、不同年龄段人群的预期选择例数及标准；

7.1.3样本类型，样本的收集、处理及保存等；

7.1.4统计学方法、统计软件、评价统计结果的标准。

7.2具体的临床试验情况

7.2.1考核试剂和对比试剂的名称、批号、有效期及所用机型等信息；

7.2.2对各研究单位的病例数、病种分布情况进行总合，建议以列表或图示方式给出具体例数及百分比；

7.2.3质量控制，试验人员培训、仪器日常维护、仪器校准、质控品运行情况，对检测精密度、室内质控（质控品测量值）、抽查结果评估；

7.2.4具体试验过程，样本检测、数据收集、样本长期保存、结果不一致样本的校验等。

7.3统计学分析

7.3.1数据预处理、差异数据的重新检测或第三方验证以及是否纳入最终数据统计、对异常值或缺失值的处理、研究过程中是否涉及对方案的修改。

7.3.2定量值相关性和一致性分析

用回归分析验证两种试剂结果的相关性，以y=a+bx和R2的形式给出回归分析的拟合方程，其中：y是考核试剂结果，x是对比试剂结果，b是方程斜率，a是y轴截距，R2是判定系数，同时应给出b的95%（或99%）置信区间，定量值结果应无明显统计学差异。

另外考虑到在不同的样本浓度区间试剂的性能可能存在一定差异，因此，建议对总体浓度范围进行区间分层统计，对不同浓度区间内的结果进行相关性分析以更好的验证两种试剂的相关性。

7.4讨论和结论

对总体结果进行总结性描述并简要分析试验结果，对本次临床研究有无特别说明，最后得出临床试验结论。

8.变更事项相关的临床试验

涉及产品检测条件优化、增加与原样本类型具有可比性的其他样本类型等变更事项，临床试验总样本数至少为100例,并在至少2家(含2家)临床试验机构开展临床试验；变更参考区间的变化及增加临床适应症等变更事项，应根据产品具体变更情况，酌情增加临床试验总样本数。

（八）产品风险分析资料

1.产品主要风险：体外诊断试剂产品的风险管理报告应符合YY/T 0316—2008《医疗器械 风险管理对医疗器械的应用》的有关要求，审查要点包括：

（1）与安全性有关特征的判定可参考YY/T 0316—2008附录C。

（2）危害分析是否全面可参考YY/T 0316—2008附录E。

（3）风险控制的方案与实施、综合剩余风险的可接受性评价及生产和生产后监视相关方法可参考YY/T 0316—2008附录F、G、J、H。

白蛋白测定试剂（盒）的初始可预见性危害主要存在于产品的设计开发、生产和使用环节。如产品设计开发方面的初始可预见危害主要有：关键原材料选择、配方各组分适宜的浓度等；生产方面的初始可预见危害主要有：水质的控制、准确称量、配制过程的控制（交叉污染）等；使用的初始可预见危害主要有：未限制非预期使用，未限制使用环境及人员，未告知正确使用，与生化分析仪检测系统匹配使用参数不当等。可能的风险及其控制清单详见表1。

表1 可能的风险及其控制清单

2.产品的安全性是否符合安全要求。

当产品成分中含有人源或动物源性材料时适用，应将此部分内容体现在注册的技术资料中，如综述资料和/或原材料研究。生物安全性应满足企业规定的要求，如包括但不限于HBs抗原、HIV-1/2抗体、HCV抗体及抗体检测为阴性。

（九）产品技术要求

申请人应当在原材料质量和生产工艺稳定的前提下,根据申请人产品研制、前期临床评价等结果,依据国家标准、行业标准及有关文献，按照《关于发布医疗器械产品技术要求编写指导原则的通告》（国家食品药品监督管理总局通告2014年第9号）的有关要求，编写产品技术要求，内容主要包含产品性能指标和检验方法。

1.产品适用的相关标准

（1）GB/T 191—2008 包装储运图示标志

（2）GB/T 21415—2008 体外诊断医疗器械 生物样品中量的测量 校准品和控制物质赋值的计量学溯源性

（3）GB/T 26124—2011 临床化学体外诊断试剂（盒）

（4）YY/T 0316—2008 医疗器械 风险管理对医疗器械的应用

（5）YY 0466—2003 医疗器械 用于医疗器械标签、标记和提供信息的符号

（6）YY/T 1228—2014白蛋白测定试剂（盒）

注：以上标准适用最新版本。

2.主要性能指标

2.1外观：至少应符合如下要求：

2.1.1试剂（盒）各组分应齐全、完整、液体无渗漏、无破损；

2.2.2中英文包装标签、标识字迹应清晰。

2.2装量：应不少于标识量。

2.3试剂空白吸光度：应符合生产企业宣称的要求。

2.4分析灵敏度：用已知浓度或活性的样品进行测试，记录在试剂（盒）规定参数下产生的吸光度改变。换算为n单位吸光度差值（ΔA）或吸光度变化（ΔA/min）。应符合生产企业给定范围。

2.5线性范围：

用达到线性区间下限的低浓度样本稀释达到线性区间上限的高浓度样本，混合成至少5个稀释浓度（xi）。用试剂（盒）分别测试以上样本，每个稀释浓度测试3次，分别求出每个稀释浓度检测结果的均值（yi）。以稀释浓度（xi）为自变量，以检测结果均值（yi）为因变量求出线性回归方程y=a+bx。计算线性回归的相关系数（r）。

稀释浓度（xi）代入求出线性回归方程，计算yi的估计值及yi与估计值的相对偏差或绝对偏差。

试剂（盒）线性在[10.0，60.0]g/L区间内：

2.5.1相关系数r值≥0.990。

2.5.2[10.0，20.0]g/L区间内，线性偏差应不超过±4.0g/L；[20.1，60.0]g/L区间内，线性偏差应不超过±10％。

2.6精密度

2.6.1重复性：在重复性实验条件下，同一批次试剂对检测范围内某个浓度的白蛋白样本进行重复检测10次，变异系数CV（%）≤2.0%。

2.6.2批间差：三个批次的检测试剂对检测范围内某个浓度的白蛋白样本进行重复性检测，其变异系数CV（%）值应≤5.0%。检测结果计算公式如下：

2.7准确度：用可用评价常规方法的有证参考物质(CRM)对试剂（盒）进行测试，重复检测3次，取测试结果均值（M），按公式（3）计算相对偏差（B%）。相对偏差应不大于±6.0%。

B%＝(M－T)／T×100% ………………………………（3）

式中：M为测试结果均值；

T为标准物质标示值，或各浓度人血清定值。

2.8稳定性

2.8.1开瓶稳定性：试剂（盒）在规定的贮存条件下保存至规定的时间，产品的性能应至少符合线性、准确度和重复性的要求。

2.8.2复溶稳定性（干粉或冻干试剂适用）：干粉试剂开瓶后（复溶后）在规定的贮存条件下保存至预期时间内，产品的性能应至少符合线性、准确度和重复性。

2.8.3效期稳定性：试剂（盒）在规定的贮存条件下保存至有效期末，产品的性能应至少符合线性、重复性和准确度的要求。

2.9校准品和质控品（如适用）

若试剂盒配套校准品和质控品，应参照GB/T 21415—2008《体外诊断医疗器械 生物样品中量的测量 校准品和控制物质赋值的计量学溯源性》的要求溯源至国家或国际标准物质，并提供校准品溯源性文件及质控品定值说明。溯源性文件中应有赋值程序、溯源链和不确定度及其评定要求。

（十）产品注册检验报告

根据《体外诊断试剂注册管理办法》要求，首次申请注册的第二类产品应提供具有相应医疗器械检验资质和承检范围的医疗器械检验机构出具的注册检验报告和产品技术要求预评价意见。

（十一）产品说明书

产品说明书的格式应符合《关于发布体外诊断试剂说明书编写指导原则的通告》（国家食品药品监督管理总局通告2014年第17号）的要求。产品说明书的所有内容均应与申请人提交的注册申报资料中的相关研究结果保持一致,下面对白蛋白测定试剂(盒)说明书的重点内容进行详细说明，以指导注册申报人员更合理地完成说明书编制。

1.【预期用途】

白蛋白测定试剂盒用于体外定量检测血清和/或血浆中白蛋白浓度，适用的样本类型应结合实际的临床研究情况进行确认。临床上主要用于肝脏功能及营养状况等疾病的辅助评价等。

2.【检测原理】

白蛋白在一定pH值缓冲液中（pH4.2—5.2）带正电荷，在有非离子型表面活性剂存在时，可与带负电荷的染料（溴甲酚绿或溴甲酚紫）结合产生有色（蓝绿色或绿色）复合物，在一定波长（600—630nm）处比色，颜色的深度与白蛋白浓度成正比。与同样处理的白蛋白标准比较，可求得白蛋白含量。

3.【主要组成成分】

（1）说明试剂包含主要组分的名称、数量、比例或浓度等信息。

（2）试剂中不包含但对该项检测必须的组分，企业应列出相关试剂/耗材的名称、货号及其他相关信息。

（3）试剂盒中不包含质控品或其他耗材，应说明经验证后推荐配合使用的商品化质控品、校准品或其他耗材的生产企业、产品名称以及产品货号等详细信息；如包含校准品和/或质控品，应说明其主要组成成分及其生物学来源，校准品应注明其定值及溯源性，质控品应明确靶值范围。

4.【储存条件及有效期】

试剂的开封稳定性、效期稳定性、运输稳定性等信息做详细介绍。并对开封后未使用产品允许暴露于空气中的温度、湿度及有效期等条件予以明确。

5.【样本要求】重点明确以下内容：

（1）样本采集：采集时间点是否受临床症状、用药情况等因素的影响，具体采集部位及类型，详述具体的操作方法或列出相关操作指南文件以指导使用者（最好能够给出具体图示），尽量减少由于样本采集或处理不当对实验造成的影响。

（2）若待测样本为血浆应说明所采用的抗凝剂类型。

（3）样本处理及保存：样本的保存条件及期限（短期、长期）、运输条件等。冷藏/冷冻样本检测前是否须恢复室温，冻融次数限制。

6.【适用仪器】所有适用的仪器型号，并提供与仪器有关的重要信息以指导用户操作。

7.【检验方法】详细说明实验操作的各个步骤，包括：

（1）实验条件：实验环境的温度、湿度等注意事项，检验试剂及样本复温等要求。

（2）试剂使用方法（手工/半自动/全自动）、注意事项。

（3）详述待测样品的预处理方法、步骤及注意事项。

（4）明确样本检测加样量及反应时间。

（5）详述配套仪器设置过程。

（6）质量控制过程以及注意事项。

8.【检验结果的解释】

结合质控品对所有可能出现的结果进行合理的解释。本试剂的检测结果仅供临床参考，对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。明确有可能存在的数值升高因素及数值降低因素，说明对何种条件下需要进行重复检测，以及在重复检测时对待测样本可能采取的优化条件等进行详述。

9.【检验方法的局限性】

（1）明确干扰物质及浓度范围对检测结果的影响；

（2）操作时必须严格按照操作规程，精心操作才能得到正确结果，对操作程序作任何修改都可能影响结果。

（3）检测结果超出试剂盒线性范围的处理方法。

（4）不同方法pH值要求对测定结果的影响

10.【产品性能指标】

说明该产品主要性能指标，应至少包括：外观、装量、试剂空白吸光度、分析灵敏度、线性范围、精密度、准确度和稳定性等。产品性能指标应不低于YY/T 1228—2014 《白蛋白测定试剂（盒）》标准要求。

11.【注意事项】

应至少包括以下内容：

（1）有关人源组分（如有）的警告，如：试剂内校准品或其他可能含有人源物质的组分，虽已经通过了HBs-Ag、HIV1/2-Ab、HCV-Ab等生物传染性项目的检测，但截至目前，没有任何一项检测可以确保绝对安全，故仍应将这些组分作为潜在传染源对待。

（2）建议实验室的环境要求，如环境温度、湿度等。

（3）对采集样本的要求，建议使用新鲜血清或血浆，勿使用溶血样本，明确样本的处理办法。

（4）对所有样本和反应废弃物都视为传染源进行处理。

（5）不同方法应说明对检测结果的影响因素；使用不同生产商的试剂对同一份样本进行检测可能会存在差异。

（6）本试剂盒的检测结果仅供临床参考，对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。

12.【参考文献】

注明引用的参考文献。

13.【基本信息】

（1）注册人与生产企业为同一企业的，按以下格式标注基本信息：

注册人/生产企业名称

住所

联系方式

售后服务单位名称

联系方式

生产地址

生产许可证编号

（2）委托生产的按照以下格式标注基本信息：

注册人名称

住所

联系方式

售后服务单位名称

联系方式

受托企业的名称

住所

生产地址

生产许可证编号

三、审查关注点

（一）产品名称的要求

试剂（盒）的命名应参考食品药品监管部门发布的医疗器械分类目录或国家标准、行业标准上的通用名称，一般为“白蛋白测定试剂（盒）（溴甲酚绿法）、白蛋白测定试剂（盒）（溴甲酚紫法）”。

（二）试剂（盒）组成（见注册申报资料要求）

（三）反应机理或工作原理（见注册申报资料要求）

（四）试剂主要性能指标及其计算方法（见注册申报资料要求）

（五）产品适用的相关标准

表2 相关产品标准

产品适用及引用标准的审查可以分两步来进行。首先对引用标准的齐全性和适宜性进行审查，也就是在编写注册产品技术要求时与产品相关的国家、行业标准是否进行了引用，以及引用是否准确。

其次对引用标准的采纳情况进行审查。即所引用标准中的条款要求，是否在产品技术要求中进行了实质性的条款引用。这种引用通常采用两种方式，文字表述繁多内容复杂的可以直接引用标准及条文号，比较简单的也可以直接引述具体要求。

产品技术要求应符合相关的强制性国家标准、行业标准和有关法律、法规的规定，并按国家食品药品监督管理局发布的《医疗器械产品技术要求编写指导原则》的要求编制。

（六）产品说明书和标签样稿

应符合《医疗器械说明书和标签管理规定》（国家食品药品监督管理总局令第6号）和《体外诊断试剂说明书编写指导原则》的要求，同时应符合YY/T 0466.1 《医疗器械 用于医疗器械标签、标记和提供信息的符号 第1部分：通用要求》（ISO15223-1）。

四、名词解释

（一）准确度（Accuracy）：一个测量值与可接受的参考值间的一致程度。

（二）分析灵敏度（Analytical Sensitivity）：样品中以一定概率可被声明与零有差异的被测量的最低值。本指导原则中的分析灵敏度是指测定规定浓度样本，在试剂盒规定参数读数点下的吸光度值（A）或差值（ΔA）为检测系统的分析灵敏度。

（三）精密度（Precision）：在规定条件下，相互独立的测试结果之间的一致程度。精密度的程度是用统计学方法得到的测量不精密度的数字形式表示，如标准差（SD）和变异系数（CV）。

五、参考文献

（一）《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号）

（二）《关于发布体外诊断试剂临床试验技术指导原则的通告》（国家食品药品监督管理总局通告2014年第44号）

（三）《关于发布体外诊断试剂说明书编写指导原则的通告》（国家食品药品监督管理总局通告2014年第17号）

（四）《食品药品监管总局关于印发体外诊断试剂分类子目录的通知》（食药监械管〔2013〕242号）

（五）《临床检验质量管理技术基础》，冯仁丰，第二版，上海科学技术文献出版社，2007年4月

（六）临床化学体外诊断试剂(盒)产品技术审评规范（2011版）

（七）GB/T 21415—2008 体外诊断医疗器械－生物样品中量的测量－校准物和控制物质赋值的计量学溯源性（ISO 17511:2003，IDT）

（八）WS/T 404.2—2012 临床常用生化检验项目参考区间 第2部分：血清总蛋白、白蛋白

（九）定性检测体外诊断试剂(盒)产品技术审评规范（2012版）

（十）YY/T 1228—2014 白蛋白测定试剂（盒）

白蛋白测定试剂（盒）注册技术审查指导原则

编制说明

一、指导原则编写目的

（一）本指导原则编写的目的是用于指导和规范白蛋白检测试剂（盒）产品注册申报过程中审查人员对注册材料的技术审评；同时也可指导生产企业的产品注册工作。

（二）本指导原则旨在让初次接触该类产品的注册审查人员对产品机理、结构、主要性能、预期用途等各个方面有所了解，同时让技术审查人员在产品注册技术审评时把握基本的尺度，对产品安全性、有效性作出系统评价。

二、指导原则编写依据

本指导原则编写主要依据如下：

（一）《医疗器械监督管理条例》（国务院令第650号）

（二）《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号）

（三）《关于发布体外诊断试剂临床试验技术指导原则的通告》（国家食品药品监督管理总局通告2014年第44号）

（四）《关于发布体外诊断试剂说明书编写指导原则的通告》（国家食品药品监督管理总局通告2014年第17号）

（五）YY/T 1228—2014《白蛋白测定试剂（盒）》

（六）《全国临床检验操作规程》（第三版）

（七）国家食品药品监督管理部门发布的其他规范性文件

（八）现行的国家标准和行业标准

三、指导原则部分内容编写考虑

（一）产品的主要技术指标制定主要参考相关国家标准、行业标准YY/T 1228—2014《白蛋白测定试剂（盒）》、GB/T 26124—2011《临床化学体外诊断试剂（盒）》。

（二）为了提高本指导原则的通用性，编写中明确本指导原则适用于BCG和BCP法。由于其他样本类型测定方法（比浊法、酶标法和其他染料和化学试剂等），如胸腹水、脑脊液、尿液样本中白蛋白测定方法在制定国家标准、行业标准的性能指标上不一致，如果拟申报试剂已有相应的专用国家/行业标准或相应方法学的通用标准要求发布，则企业标准的要求不得低于上述标准要求。

四、指导原则编写单位和人员

本指导原则的编写成员由江西省食品药品监督管理局、江西省药品审评中心、江西省医疗器械质量监督检验中心等专家共同组成。

一文总结│膀胱癌生物学发展与相关治疗进展

非常荣幸有机会和各位同道们一起来交流「结核病的病原学诊断进展」，结核的最终诊断仍需要病原的一锤定音。

目前，结核病成为严重全球的公共健康问题，中国结核病诊疗现状是发病率高（全球发病人数第3位的国家） ，而患者细菌学检测率低 ；耐多药结核病高发（估算率：7.1%）、耐药结核患者实验室检出率低、90%以上病患在综合医院首诊，但综合医院重视程度不够……到目前为止，大多数综合医院都没有结核病房，「患者确诊阳性后就转到专科医院」是非常常态的。

而临床医生对结核病诊断意识相对较弱，现有临床应用的主要诊断方法除了病史及体格检查，还有细菌学培养（金标准）、分子生物学检测、影像学、免疫学（结核潜伏感染）、病理学等。

涂片染色、固体培养、液体培养、鉴定试验、药敏试验。

建议同时进行萋尼染色和荧光染色，但目前很多实验室只做抗酸染色。萋尼染色对检验技术的要求还是比较高的，需要在油镜下看很多视野。相对来说，荧光染色可以在高倍镜下看，看片速度较快。

有固体培养、液体培养。分枝杆菌属种属多，一定要区别培养物是结核分枝杆菌还是非结核分枝杆菌。另一方面，对于来说，可以通过药敏检测来区别它是敏感的、还是多重耐药（MDR ）或泛耐药（XDR） 。

我们医院（编者注：北京大学人民医院）目前未做TB常规药敏试验，我借用了上海肺科医院检验科余方友主任一张幻灯片。

作为收专门收结核病的医院，我们可以看到，上海肺科医院做了培养之后的「路径」还是非常复杂的。

如果培养阴性，6周之后可以报告阴性结果。

如果培养阳性，需要涂片进行抗酸染色（AFBT）做初步鉴定，如染色阴性，可以再做培养。如果阳性但合并杂菌，需要分纯，继续培养7天，进行二次处理。如果培养阳性、抗酸染色阳性AFB阳性，这时可用MPT64抗原检测方法判断是结核还是非结核。如果抗原阳性，把它转种到罗氏培养基上，进一步做MIC药敏检测；如果抗原是阴性，接种PNB的培养基，观察是否生长，然后进行菌种鉴定（包括质谱法或分子生物法）。

从抗酸染色开始说起，抗酸染色便宜价廉，但能做好非常不易，除了有一些敏感度方面的问题，不同实验室做出的结果也是不一样的，这与涂片的水平有关系，有些片子涂得不好，「啪」一洗，就冲掉了一半。

萋-尼氏染色的劳动强度大，至少观察300个视野，荧光染色至少观察50个视野才能够报阴性，而且也不是走马观花式扫一眼，要仔细看每一个视野。涂片镜检检出限为10^4CFU/ml，Xpert 检出限131CFU/ml，从特异性来看，无法区分出非结核分枝杆菌。

中国CDC关于结核病实验室检测给出了非常详细的萋-尼染色、荧光染色、培养的前处理等SOP，我简单给大家汇报一下：

报告规则（萋-尼染色）300个视野，一般需要5分钟以上；每个工作日，一位镜检人员的玻片阅读量不应超过25张，且连续阅读10～12张玻片后，应休息20分钟左右。

萋-尼氏染色抗酸杆菌：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌；

抗酸杆菌菌数1～8条/300视野时，萋-尼氏染色抗酸杆菌，再分起级别的话， 萋-尼氏染色抗酸杆菌3～9条/100视野，连续观察300个视野；1～9条/10视野，连续观察100个视野；1～9条/1视野；≥10条/1视野。

我们可以看到，每一个细节都要把控——该涂多少？不同的标本怎么处理？加氢氧化钠还是不加？离心不离心？集菌不集菌？

结核菌需要先培养出来（2-6周） ，再加入不同浓度抗菌药物的培养基中，继续培养4-8周报告药敏结果。下图中，左边显示的是经典的罗氏固体培养基，因为它是固体，所以培养的时间相对较长，菌落是黄色的、粗糙的；还有WHO所推荐的液体培养基，相对来讲，液体的培养时间较短。

AFB的检测限（10000 CFU/ml）是涂片镜检发现抗酸杆菌的阈值。当疾病没有发展到这个阶段的时候、痰里还没有达到涂片检测阈值时，我们只通过涂片的方法，有可能会延误诊断，而在这个阶段里、患者可能在社区已经传播结核了。所以，我们需要开发适用于基层实验室的高灵敏度的检测方法。

上图从左至右所显示的分别是抗酸涂片（红色、杆状）、固体培养（干菜花状）、液体培养（清亮、颗粒状沉淀）。

到目前，「培养」仍然是结核病原诊断的金标准，推荐进行快速分枝杆菌培养 （液体法）， 如果抗酸染色涂片阳性是10000 CFU/ml 的话，那么固体培养需>100 CFU/ml才能够培养出来，8周以后才能报阴性结果，液体培养是敏感度相对较好的，仅需>10CFU/ml，但仍然是需要6周之后才能够报阴性结果。

我想各位老师已经看过了，在诊断标准里写得非常清楚：——结核分枝杆菌核酸检测阳性；——肺结核的诊断是以病原学（包括细菌学、分子生物学）检查为主，结合流行病史、临床表现、胸部影像、相关的辅助检查及鉴别诊断等，进行综合分析做出诊断。以病原学、病理学结果作为确诊依据。同时也强调，是「结核分枝杆菌核酸检测阳性+胸部影像学检查」支持即可确诊，也不是必须要等培养结果。

图中包括肺结核（肺组织、气管、支气管和胸膜的结核）疑似病例、临床诊断病例和确诊病例的诊断标准。

这几年，分子生物学及其他技术快速发展，结核菌素试验渐渐地被γ-干扰素释放试验 （IGRAs）所替代；传统镜检也被LED/FM镜检替代；固体培养被液体培养替代；传统的表型药敏试验也在被分子生物学药敏试验代替；在传统的PCR方面，我们希望有一种小型化的、快速的、像poct的、适合基层筛查的方法，新技术包括全自动一体化试剂盒式核酸扩增试验 （NAATs）等 。

包括实时荧光定量PCR检测DNA（IS6110、HSP65、rpoB等） ；半巢式全自动实时荧光定量PCR检测（Xpert MTB/RIF）；环介导等温扩增法(LAMP） ；实时荧光核酸恒温扩增检测技术；交叉引物扩增技术（CPA） ；线性探针技术……

包括探针杂交；熔解曲线；测序；基因芯片等。

液体培养是一个非常好的技术，如果每毫升有1~3个菌就能够测出来，只是需要的时间比较长；Xpert MTB/RIF是每毫升131个菌可以检测出来……但敏感性高就更好吗？核酸存在并不一定代表是活菌存在，MGIT培养出来肯定是活菌。

检测的时间最长5个小时，短的大概2个小时就可以出结果。

这是WHO推荐和新锐TB诊断和药敏分子技术，蓝色是WHO目前公认的方法，应用的时间比较久了，而下面的黄色的是最新新锐技术。

大家可能也比较熟悉了，它是小型化的，非常「傻瓜式」，在1～2小时之内完成的测试，能够同时检测结核分枝杆菌及其对利福平耐药性的分子诊断试验；对于诊断结核病，包括合并HIV感染的结核病，比涂片镜检更加敏感，其敏感度和固体培养接近；GeneXpert平台，操作简单，对实验室条件要求低。

在中，应优先使用Xpert MTB/RIF对成人及儿童MDR-TB和HIV合并感染进行诊断，而并非传统的涂片镜检、培养和药敏试验；（适用于资源条件好的地区）怀疑为结核病的所有成人及儿童，可以优先使用Xpert MTB/RIF 诊断，而非传统的涂片镜检和培养。

，怀疑患有「结核性脑膜炎」的患者中，Xpert MTB/RIF应优先于传统涂片镜检、培养和药敏而作为初始诊断方法对来源于患者的脑脊液标本进行检测；（适用于资源条件好的地区） 怀疑为肺外结核的患者中，Xpert MTB/RIF可以用于检测特殊的非呼吸道标本（如淋巴结和其它组织），替代传统的涂片镜检、培养、和/或组织病理学检查。

（肺外结核在HIV感染低流行地区可占结核发病人数的15-20%。在HIV感染高流行地区比例更高。因为肺外结核组织中往往菌含量偏低，导致原来对肺外结核微生物检测的强调不足。）

从上至下分别为：1、痰涂片镜检 - 肺结核；2、核酸扩增（除Xpert以外）- 肺及肺外结核（高特异性和阳性预测值，但敏感性和阴性预测值较低）；3、Xpert MTB/RIF - 肺 及 肺外结核 及利福平耐药；4、液培和MPT64 快速鉴定试验 - 肺及肺外结核分型。

因为它不需要特别昂贵的仪器，这种等温的、小型的一个设备就可以完成。

药敏试验的需求是很大的，是经典方法，但操作繁琐、耗时长；市场占有量最大，仪器自动判读，检测时间缩短；药物种类多，浓度范围宽；还有最新的，快速高效、生物安全，但是成本较高。

这篇文章发表在《Arch Med Res》上，针对2017年6月~2018年5月 123例疑似活动性结核感染患者研究，任何单一诊断效果都没有那么好，Xpert和mNGS的联合诊断效果优于三种方法中的任何一种。

2018年纳入了20例肺组织标本，比较常规实验室检测方法与mNGS技术，可见宏基因组测序在肺部真菌感染和结核感染的诊断中具有优势。

这是我们课题组陈宏斌副研究员自建的肺泡灌洗液mNGS检测流程。

mNGS能够检出更多病毒和真菌，对细菌来说差异不是很大。73例未培养出结果的LRTI，mNGS检出42例，包括部分CAP病原体；GeneXpert TB PCR试剂盒检测到5例结核分枝杆菌，而mNGS仅检测到其中1例 ；59例做了DNA-seq+RNA-seq，4例检出RNA病毒（3CAP+1HAP）。

TST试验的优点是简单易行 、价格相对低；缺点是易受主观因素影响，非结核分枝杆菌（NTM）感染和卡介苗(BCG)可导致假阳性；在免疫缺陷病人中检出率较低 ；在没有接受BCG接种人群中或出生时及婴幼儿期接种BCG人群中的特异性尚可。

我们重点看一下 ，有两种方法：

对全血中致敏T细胞再次受到结核分枝杆菌特异性抗原刺激后所释放的IFN-γ水平进行检测，被称为全血检测或结核感染T细胞免疫检测；以德国凯杰的QuantiFERON-TB为代表。

在结核分枝杆菌特异性抗原刺激下, 测定外周血单个核细胞中能够释放IFN-γ的效应T细胞数量。以英国牛津的T.SPOT为代表。

在很多方面，包括，特别是5岁以下儿童具备临床表现，有肺结核患者接触史或结核菌素皮肤试验中度阳性或强阳性或

在上，当患者具备胸部影像学特征，经鉴别诊断排除其它肺部疾病，同时符合下列项目之一者，可以确诊。

-临床表现：症状和体征

-结核菌素皮肤试验，中度阳性或强阳性

-Ɣ-干扰素释放试验阳性

-结核分枝杆菌抗体阳性

-肺外组织病理检查证实为结核病变者

具备胸部影像学特征，临床表现：症状和体征，经鉴别诊断排除其它肺部疾病，结核菌素皮肤试验中度阳性或强阳性或。

（胸部影像学检查：急性血行播散性肺结核表现为两肺均匀分布的大小、密度一致的粟粒阴影；亚急性或慢性血行播散性肺结核的弥漫病灶，多分布于两肺的上中部，大小不一，密度不等，可有融合。儿童急性血行播散性肺结核有时仅表现为磨玻璃样影，婴幼儿粟粒病灶周围渗出明显，边缘模糊，易于融合。）

Xpert MTB技术在肺组织、痰液、肺泡灌洗液、脑脊液、关节液和肺外淋巴结等多种标本中具有高灵敏度(>85%)和高特异度(>99%) ，但在以胸水为标本检测结核性胸膜炎有限制。

研究限制性说明：1、本研究为单中心回顾性研究；2、PKUPH不是结核专科医院，某些病例未送检结核培养，因而金标准是参考了WHO指南和国内指南(WS 288—2017)的复合参考标准（CRS）。

既然使用Xpert检测胸水标本诊断结核性胸膜炎（TPE）时灵敏度过低（15%），我们有时非常难以区分到底是结核性的胸膜炎，还是恶性肿瘤、结缔组织病？或是复杂性肺炎导致的积液？近期，我们又做了另外一个研究：

用11种生物标志物及比值区分多种胸腔积液病；对于TPE、恶性胸腔积液（MPE）、复杂性肺炎旁积液（CPPE）、简单性肺炎旁积液（UPPE）、结缔组织病引发胸水（PE caused by CTD）；运用这些参数构建决策树，以鉴别诊断5种不同类胸腔积液。

如图所示，我们也综合了很多的其他的指标，最终结论是诊断TPE的灵敏度为100.0% ，特异度为98.7%。

仅仅知道「潜伏」了并不够，还得知道它什么时候会成为活动性的。分享文献里报道的一些新方法。

GBP5、DUSP3和KLF2基因对活动性结核病具有高度诊断性，可以对活动性结核病进行有效诊断，并在多个独立队列中得到验证，并且具有诊断和监测治疗反应的潜在临床应用。

WHO的共识声明确定了最佳目标产品是预测感染后两年内进展为结核病的敏感性和特异性≥90％或至少 75％，高PPV。

仍然是诊断结核病所必需的，药敏试验所必需，且为金标准方法，但时间长；是大势所趋，包括耐药性的检测——未确诊的具有临床症状的结核病可疑患者，至少一份呼吸道标本应采用分子诊断技术进行检测；免疫学检测可作为结核病的辅助诊断手段。与此同时，很多（mNGS、转录组、代谢组）在不断进步。

王辉

医学博士，博士生导师，教授，研究员。现任北京大学人民医院检验科主任，北京大学医学部检验学系主任，国家杰出青年基金获得者。作为亚洲唯一代表，担任美国临床和实验室标准化协会（CLSI）药敏折点制定工作组委员，担任亚洲耐药菌监测网（ANSORP）委员会常务委员、全球华人临床和感染病学会常务理事、中华医学会微生物学与免疫学分会常务委员、秘书长和临床微生物学组组长、中华医学会检验医学分会委员和临床微生物学组组长等。